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      細胞培養常見(jiàn)問(wèn)題及其解決

      發(fā)布時(shí)間:2021-04-09 17:38:29

      1.?如何選用特殊細胞系培養基?

      培養某一類(lèi)型細胞沒(méi)有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(cháng)??傊?,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個(gè)好的開(kāi)始。

      2.?何時(shí)須更換培養基?

      視細胞生長(cháng)密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培養基即可。

      3.?可否使用與原先培養條件不同之培養基?

      不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無(wú)法立即適應, 造成細胞無(wú)法存活。

      4?可否使用與原先培養條件不同之血清種類(lèi)?

      不能。血清是細胞培養上一個(gè)極為重要的營(yíng)養來(lái)源,所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對于細胞的生長(cháng)會(huì )產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會(huì )造成細胞無(wú)法存活。

      5?何謂FBS, FCS, CS, HS ?

      FBS (fetal bovine serum)?和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

      6?培養細胞時(shí)應使用5 % 或10% CO2?或根本沒(méi)有影響?

      一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統,而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時(shí)應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí),細胞培養時(shí)應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí), 則應使用5 % CO2 培養細胞。

      7.Hank's?平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?

      HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會(huì )變堿,Hanks液在CO2培養箱中會(huì )變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

      8.?細胞之接種密度為何?

      依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無(wú)法生長(cháng)之一重要原因。

      9.?懸浮性細胞應如何繼代處理?

      一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時(shí), 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。

      10.冷凍管應如何解凍?

      取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí), 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。

      11.?細胞冷凍管解凍培養時(shí), 是否應馬上去除DMSO?

      除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無(wú)法生長(cháng)或貼附之問(wèn)題。

      12.?附著(zhù)性細胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

      一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會(huì )。

      13.欲將一般動(dòng)物細胞離心下來(lái),其離心速率應為多少轉速?

      欲回收動(dòng)物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過(guò)高之轉速, 將造成細胞死亡。

      14.?細胞冷凍培養基之成份為何?

      動(dòng)物細胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來(lái)細胞生長(cháng)用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì )放出大量熱能,故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。

      15.DMSO?之等級和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何?

      冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無(wú)菌狀況, 第一次開(kāi)瓶后應立即少量分裝于無(wú)菌試管中, 保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì), 并可減少污染之機會(huì )。若要過(guò)濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

      16.冷凍保存細胞之方法?

      冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(cháng)期儲存。

      冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長(cháng)期儲存。*-20 °C 不可超過(guò)1 小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。

      17.?細胞欲冷凍保存時(shí), 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

      冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

      18.培養基中是否須添加抗生素?

      除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態(tài)下, 培養基中不應添加任何抗生素。

      19.應如何避免細胞污染?

      細胞污染的種類(lèi)可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無(wú)菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來(lái)源和培養基配制是減低污染之最好方法。

      20.如果細胞發(fā)生微生物污染時(shí),應如何處理?

      原則上:直接滅菌后丟棄之。

      當重要的培養污染時(shí),研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開(kāi),用實(shí)驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過(guò)濾器。
      高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實(shí)驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè )菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實(shí)驗步驟。

      1.在無(wú)抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。

      2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個(gè)小培養瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

      3.每天觀(guān)測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。

      4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。

      5.在無(wú)抗生素的培養基中培養細胞一代。

      6.重復步驟4。

      7.在無(wú)抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。

      21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞,是否能以肉眼觀(guān)察出異狀?

      不能。除極有經(jīng)驗之專(zhuān)家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無(wú)法以其外觀(guān)分辨之。

      22.支原體污染會(huì )對細胞培養有何影響?

      支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長(cháng)參數, 代謝及研究之任一數據。故進(jìn)行實(shí)驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實(shí)驗結果之數據方有意義。

      23.?偵測出細胞株有支原體污染時(shí), 該如何處理?

      直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

      24. CO2?培養箱之水盤(pán)如何保持清潔?

      定期(至少每?jì)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

      25.為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會(huì )偏暗紅色, 且pH值會(huì )越來(lái)越偏堿性?

      培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會(huì )逐漸溢出,造成培養基越來(lái)越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì )隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長(cháng)停滯或死亡。若培養基偏堿時(shí),可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2, 以調整pH 值。

      26.?各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?

      不同廠(chǎng)牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒(méi)有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠(chǎng)牌不同之dish 或flask 而有顯著(zhù)之生長(cháng)差異。

      27.?購買(mǎi)之細胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì )發(fā)生細胞數目太少之情形?

      研究人員在冷凍細胞之培養時(shí)出現細胞數目太少, 大都是因為離心過(guò)程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長(cháng)隔夜后再更換培養基即可。

      28.購買(mǎi)之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

      研究人員在細胞培養時(shí)出現存活率不佳, 常見(jiàn)原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。

      29.?收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?

      冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時(shí)用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

      30.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

      L-谷氨酰胺在細胞培養時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì )降解,但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

      31.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩定?

      GlutaMAX-I?二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
      GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

      32.什么培養基中可以省去加酚紅?

      酚紅在培養基中用作PH值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類(lèi)反應,培養細胞,尤其是哺乳類(lèi)細胞時(shí),用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時(shí),不使用加有酚紅的培養基。

      33.如何用臺盼蘭計數活細胞?

      用無(wú)血清培養基把細胞懸液稀釋到200~2000個(gè)/毫升,在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色細胞是死細胞。

      34.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

      丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒(méi)有葡萄糖的話(huà),細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

      35.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?

      二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來(lái)自培養基中所有的二價(jià)離子。

      36.室溫下配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時(shí)PH值是多少?

      緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時(shí),不同PH值。

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      37.如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

      我們推薦使用脫落細胞的方法,此技術(shù)破壞性最小,生活力最高。通過(guò)使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。

      38.胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細胞:

      1.?去除培養基。

      2.?用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。

      3.?加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。

      4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

      5.?向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。)

      6.?離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。

      7.?用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

      39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時(shí),肝素的使用量是多少?

      為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

      40.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著(zhù)傳代的次數的增加,它的感染能力會(huì )降低嗎?

      通常情況當細胞經(jīng)過(guò)30次傳代后,應該返回凍存。無(wú)論什么時(shí)候計數時(shí),都應該檢查細胞活力。如果超過(guò)95%的細胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降,它們的感染力將不在是有效的。

      41.貯存在冰箱中的瓶口已開(kāi)的培養基,在放置幾天后顏色變紫?

      這主要是由于在暴露到周?chē)腃O2水平時(shí),碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開(kāi)瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來(lái)校正溶液的pH值(確定松開(kāi)瓶口以保證氣體交換)。

      42.?細胞培養基偶然被凍,可否繼續使用?

      如果細胞培養基偶然被凍,您應該熔化培養基并觀(guān)察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,只能丟棄這些培養基。

      43.?無(wú)血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎?

      當在無(wú)血清培養基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì )結合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。

      44.?培養基中添加了血清和抗生素后,可長(cháng)期保存嗎?

      一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時(shí),您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開(kāi)始降解。

      45.培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?

      大部分添加物和試劑最多可以?xún)鋈?次,如果次數更多都會(huì )在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會(huì )影響它的性能。

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