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      特殊培養法

      發(fā)布時(shí)間:2021-04-09 17:38:29

      1)二倍體細胞培養法

      二倍體細胞培養法與一般培養相同,關(guān)鍵在于傳代,其傳代程序為:

      1. ? ? ?吸除舊培養液注入另瓶中。

      2. ? ? ?用溫BSS沖洗1次。

      3. ? ? ?用0.25%溫胰蛋白酶消化,加入消化液量以?xún)H覆蓋細胞層即可;作用1~5分鐘。

      4. ? ? ?待細胞附著(zhù)松動(dòng)、細胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大,便終止消化。為防止細胞丟失,可不必再用BSS沖洗,直接向瓶中加入培養液(新舊培養液按2:1新舊混合)。

      5. ? ? ?輕輕反復吹打制成單個(gè)細胞懸液。

      6. ? ? ?按一分為二比例接種培養。

      2)支持物培養法

      加支持物培養法與一般培養法相同,只是在培養前需在培養瓶中加入已經(jīng)消毒的支持物。

      1. ? ? ?支持物制備:如用特氟隆薄膜,無(wú)菌條件下啟封,用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊,于培養接種細胞前,先置入培養容器中即可;通常多用蓋玻片做支持物,用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài),以便裝入培養瓶中,然后按如下順序處理:自來(lái)水浸泡24小時(shí)—96%酒精30~60 min—蒸餾水浸泡30~60 min—用干凈軟布擦拭干凈—裝入培養皿中—高壓或干熱滅菌備用。

      2. ? ? ?培養法:初代消化培養、初代組織塊培養、傳代培養等皆可應用加支持物培養法。接種細胞后,可在任何時(shí)間取出支持物,做各種觀(guān)察或實(shí)驗。

      3)細胞分離(克?。┡囵B

      多孔塑料培養板單細胞克隆法:

      1. ? ? ?消化:取健康待克隆細胞,吸出瓶?jì)扰囵B液,加消化液。

      2. ? ? ?低密度細胞懸液的制備:做克隆細胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細胞懸液,然后稀釋細胞,使之成為1~2細胞/毫升懸液,最適宜細胞密度為1~2細胞/ml培養液。

      3. ? ? ?接種:先用吸管輕輕吹打細胞懸液,使混懸均勻,繼用加樣器向塑料培養板每孔內加0.5毫升。接種時(shí)要迅速準確,爭取在最短時(shí)間內加完,以免培養液蒸發(fā),然后迅速蓋好蓋板,置CO2溫箱培養。

      4. ? ? ?標記:培養6~12小時(shí)后,待細胞下沉冰貼附于培養板孔底后,從溫箱中取出,置倒置光顯微鏡臺上,觀(guān)察和標記下含有單個(gè)細胞的孔,置CO2溫箱培養。在培養中一般無(wú)需換液,只有在細胞增長(cháng)過(guò)于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養基,但不要吸除過(guò)多,余少許,以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養液,繼續培養3~4周。待孔內細胞增至500~600個(gè)時(shí),可進(jìn)行分離培養。

      5. ? ? ?分離擴大培養:培養86~96小時(shí)后進(jìn)行觀(guān)察。挑選生長(cháng)良好的單細胞克隆孔,先吸除舊培養液,用Hanks洗1~2次,繼加胰蛋白酶少許,加入量已能覆蓋細胞群即可,如過(guò)多,應吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視,待發(fā)現細胞變圓時(shí),加入0.1ml含10%血清的克隆培養基,用吸管輕輕吹打,當細胞離開(kāi)底物懸浮后,一并吸入管內,移入另瓶或皿中,再補加一定量克隆培養液,置CO2溫箱中繼續培養、增殖,使之形成新的細胞群后,即轉用常規培養法培養。

      必須保證分離出來(lái)的細胞確為一個(gè)而不是兩個(gè)或更多。因此必須提高克隆形成率才易克隆成功,為此常采取以下一些措施:

      使用適應性培養基或條件培養基(Conditional Medium)。制備方法:

      1. ? ? ?培養同源細胞(未克隆前時(shí)的同一細胞)至半匯合狀態(tài)時(shí),更換一次培養液,再繼續培養24~48小時(shí)后,吸出所有培養液。

      2. ? ? ?離心:3000~4000/分離心10分鐘,吸取上清液。

      3. ? ? ?濾過(guò):再經(jīng)直徑0.22μm濾孔的濾膜過(guò)濾,低溫凍存貯備用;用時(shí)取1分適應培養基+2分培養基混合使用。

      使用飼細胞(Feeder Cells)。制備方法:

      1. ? ? ?取原代培養的人或動(dòng)物胚胎成纖維細胞,90%匯合時(shí)制成細胞懸液,再按105細胞/毫升重新接種培養。

      2. ? ? ?在細胞半匯合時(shí),準備0.25μg/ml的絲裂霉素C,按2μg/106細胞的量加入到培養瓶中過(guò)夜;或用射線(xiàn)單次照射,劑量30~50戈瑞。

      3. ? ? ?細胞經(jīng)上述處理后,Hanks液漂洗兩次、更換培養液、再培養24小時(shí),胰蛋白酶消化細胞制成懸液,按5×104(104細胞/cm2)接種入新培養基中。

      4. ? ? ?48小時(shí)后,即可用于細胞克隆之用。

      底物特殊處理

      1. ? ? ?制備濃度為1 mg/ml的多聚右旋賴(lài)氨酸的水溶液,用以濕潤培養瓶底。

      2. ? ? ?倒出多聚賴(lài)氨酸溶液,用5ml PBS沖洗一次后,可立即使用,或存數周內使用。

      4)球體細胞培養

      1. ? ? ?瓊脂鋪底的培養瓶:30ml無(wú)菌培養瓶,每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養基,冷卻,形成平坦底層后備用。

      2. ? ? ?取生長(cháng)狀態(tài)良好已連接成片的細胞,用彎頭吸管伸入瓶?jì)?,把細胞縱橫割劃成若干小區后,倒出培養液。

      3. ? ? ?加入0.25%的胰蛋白酶液,在倒置顯微鏡下邊消化邊觀(guān)察,當細胞小區邊緣微卷起后便立即終止消化,倒出消化液,用Hanks輕輕漂洗一次,加入新培養液3~5 ml,用吸管把已松動(dòng)的細胞片吸打下來(lái),分裝入1~3個(gè)含2%瓊脂培養基底層的培養瓶中,置溫箱繼續培養,數日后便可生長(cháng)成細胞球體。

      4. ? ? ?換液:培養1~2日后,如需換液,微傾斜培養瓶,令培養液集于培養瓶底角,停片刻,待球體細胞下沉后,吸除部分培養液,再補充新培養液。

      5)微載體細胞培養法

      1. ? ? ?微載體選擇:先用利用三種小量微載體做培養實(shí)驗,觀(guān)察細胞在一定時(shí)間內細胞的吸著(zhù)率和計算細胞數,以得到最大量細胞為佳。

      2. ? ? ?水化:稱(chēng)一定量的微載體放入容器中,按每克微載體加50~100ml的比例,加入無(wú)Ca2和Mg2的磷酸緩沖液(PBS),室溫下放置應不少于3小時(shí),并不時(shí)輕微攪動(dòng),然后再用新鮮PBS洗一次。

      3. ? ? ?消毒:可采用高壓蒸汽消毒,也可在水化后用70%酒精浸泡消毒,再用無(wú)菌的PBS漂洗一二次。

      4. ? ? ?傳代培養:在連續進(jìn)行微載體培養時(shí),可以不必把細胞從微載體分離下來(lái),可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進(jìn)行培養細胞能移動(dòng)到新載體上。如果進(jìn)行其它實(shí)驗或需要分離細胞進(jìn)行傳代培養時(shí),和常規培養相同,先用EDTA+胰蛋白酶溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后,可用自然沉降法,即在室溫下靜止5分鐘,微載體將先自沉在底部,細胞大部分仍在上清中,然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時(shí),需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾后,再離心濾過(guò)液,就可得到較純凈的細胞。

      6)懸浮培養法

      懸浮培養是使帖壁細胞呈懸浮狀態(tài)生長(cháng)。如所需培養的細胞本身屬懸浮生長(cháng)型,則無(wú)須做任何處理;在傳代時(shí)先做離心處理去除舊培養液,添加新培養液即可。但在培養帖附型細胞時(shí),必須進(jìn)行干擾細胞不能帖附,方法有二:

      1.用大培養瓶增加含有鐵芯的無(wú)毒的聚苯乙烯棒,在培養中進(jìn)行電磁攪拌,使細胞不能帖壁而成懸浮培養。

      2.用試管培養細胞,把試管置入帶有旋轉鼓的特制溫箱中進(jìn)行培養,旋轉鼓不停徐緩轉動(dòng),干擾細胞帖壁遂成懸浮培養。

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